反相液相色谱法测定人血浆中格列吡嗪浓度

 [摘要] 目的 建立反相液相色谱法测定人血浆中格列吡嗪浓度的方法。
          方法：格列吡嗪血浆样品在酸性条件下以二氯甲烷-正己烷（50：50）提取，以格列齐特为内标：色谱柱：Nova-pak C18柱（4.6mm×250mm，4μm）；流动相：甲醇-0.03mol/L。磷酸二氢钾（pH值=3.0）（59：41）；流速：O.8 mL/min；检测波长：228nm。结果：标准曲线线性范围20～1000μg/L；回归方程：Y=0.0034X一0.512，r=0.9992，血浆中格列吡嗪zui低检测限为15μg/L。平均提取回收率为（86.8±5.7）％，平均回收率为（104.3±4.3）％，日内RSD≤2.9％，日间RSD≤4.9％。结论：该方法具有良好的准确性、精密性和较高的灵敏度，适用于格列吡嗪的药动学研究和治疗监测。

【关键词】格列吡嗪；血药浓度；反相液相色谱法
         建立人血浆格列吡嗪含量测定方法，对服用格列吡嗪的患者进行药动学研究，对于指导患者合理用药、减少不良反应的发生有一定的临床意义。笔者建立了安全可靠、准确、灵敏的测定人血浆中格列吡嗪的反相液相色谱（RP-HPLC）法，适用于人体内格列吡嗪药动学研究。 

        1 仪器与试剂
         1．1 仪器Waters液相色谱仪：5l5泵；996二极管阵列检测器；Rheodyne 7725i进样器；2010Millenium色谱管理系统（美国Waters公司）；DZF-3型真空干燥箱（上海医用恒温设备厂）；XW-80A漩涡混合器（上海医科大学仪器厂）。
         1．2 试剂 格列吡嗪对照品（中国药品生物制品检定所，批号：960804），格列齐特原料（广东省药品检验所）；空白血浆（广州市血液中心）；甲醇（色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司）；二氯甲烷、正己烷、磷酸二氢钾均为分析纯。

        2 方法与结果 
        2．1 色谱条件分析柱：美国Waters Nova-pak Cl8柱（4.6mmx 250mm，4μm）；流动相：甲醇-0.03mol/L。磷酸二氢钾（pH值=3.0）（59 ：41）；流速：0.8mL/min；柱温：30℃；检测波长：228nm；进样量：10μL。
         2．2 内标溶液的配制 精密称取格列齐特原料适量置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成300mg/L。的内标储备液。精密量取内标储备液1.0mL置于50mL容量瓶中，用甲醇配成浓度为6mg/L 的内标溶液。
        2．3 标准溶液的配制 精密称取格列吡嗪对照品适量置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成100 mg/L。储备液。分别精密量取格列吡嗪储备液1.0mL置于50mL容量瓶中，2.0mL置于25mL容量瓶中，用甲醇配成浓度分别为2.8mg/L的格列吡嗪标准溶液。
        2．4 洋品处理 取1.0mL人血浆样品，精密加入50μL内标溶液和100μL盐酸溶液（2.0mol/L），混合均匀，加入3.0mL二氯甲烷-正己烷（50：50）置于漩涡混合器上混合5min。离心5min（6000r/min）。取有机相置于另一试管中。水相用同法重复提取2次，合并有机相，置于40℃真空干燥箱中干燥。残渣用50μL甲醇-纯化水（59：41）溶解，l0μL进样。
        2．5色谱行为在上述色谱条件下，格列吡嗪、内标峰形对称并与内源性杂质分离良好?格列吡嗪保留时间为l0.7 min，内标保留时间为l3.8min。格列吡嗪甲醇溶液、人空白血浆和血浆样品色谱图。
        2．6 标准曲线的制备 于空白血浆中加入不同浓度的格列吡嗪标准溶液适量，使药物浓度分别为20，50，100，200，500，l000μg/L，按前述方法提取、测定。以格列吡嗪与内标物的峰面积比（以吸收度之比表示）对格列吡嗪血浆浓度（C）进行线性回归。格列吡嗪标准曲线方程为Y=0.0034C一0.0512，r=0.9992。格列吡嗪血浆样品在20～1000μg/L范围内线性关系良好。
        2．7 回收率试验 于空白血浆中加入适量格列吡嗪标准溶液，得50，200，500μg/L 3种浓度的质控血浆，按前述方法提取、测定。以1d内5次测得的格列吡嗪浓度计算方法回收率，并以其峰面积与相应浓度未经提取的格列吡嗪甲醇溶液直接进样所得峰面积的比值计算提取回收率。3种质控血浆的平均提取回收率为（86.8±5.7）％，平均方法回收率为（104.3±4.3）％，日内RSD≤2.9％，日间RSD≤4.9％。
        2．8 精密度试验 按“回收率试验”项下方法配制格列吡嗪质控血浆，提取后测定。以1d内5次测定的格列吡嗪浓度计算日内精密度。另于5d内取上述格列吡嗪质控血浆每天各测定1次，计算13间精密度。
         2．9 zui低检测 限于空白血浆中加入适量格列吡嗪工作溶液，制得浓度<20μg/L并逐渐降低的一组样品。对每个浓度的样品进行提取、测定，以能达到S／N=3时样品的zui低浓度为zui低检测限。格列吡嗪zui低检测限为l5μg/L。

         3 讨论
        目前国内文献报道大多使用乙醚提取血浆中格列吡嗪 。乙醚虽然容易挥干，但使用前需要重蒸，操作繁琐且不安全。笔者采用毒性较小的二氯甲烷-正己烷（50：50）作为提取溶剂，操作简便、安全可靠，更适于推广应用。在实验中发现lmL血浆中加入5mL二氯甲烷．正己烷（50：50）提取格列吡嗪容易出现乳化现象。经反复试验，血浆样品与提取溶剂体积比为l：3可避免产生乳化现象。为了使之提取*，笔者对血浆样品进行3次提取，结果显示本法的提取回收率与固相萃取法（SPE）接近，两者均>80％。
        本实验流动相pH值为3.0，较文献报道为低，使格列吡嗪峰形得到了改善，提高了定量结果的准确性。


[参考文献]
[1] 江志强，张奇志，蒋新国，等．格列吡嗪2种片剂的药动学和人体生物利用度比较[J]．中国新药与临床杂志，2000，19（5）：381—384．