饱和流出式固相萃取法测定逍遥丸中芍药苷的含量

摘要：目的采用饱和流出式固相萃取仪（SPEHPLC）法制备逍遥丸供试品溶液，用液相色谱法测定其中芍药苷的含量。方法ZorbaxSBC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈水（20∶80）为流动相，流速为1 ml/min，检测波长为230 nm。结果芍药苷的测定在0.123 2～1.232 μg范围内线性关系良好，r＝0.999 9，平均回收率为99.16%，RSD为1.6%。结论该方法简便快速、灵敏度高、有效除去药物基质保护色谱柱，可用于逍遥丸中芍药苷的含量测定。

　　关键词：逍遥丸； 芍药苷；  固相萃取装置； 液相色谱法

　　Content Determination of Peoniflorin in XiaoYao Pill bySaturated Flowthrough SPEHPLC

　　Abstract：ObjectiveTo develop saturated flowthrough SPEHPLCmethod for the assay of Peoniflorin in XiaoYao pill.MethodsSeparation was performed on a ZorbaxSBC18 column（4.6 mm×250mm，5 μm）．The phase consisted ofacetonitrile-water（20∶80，v/v）．The flow rate was 1 ml/min．The UVdetection was set at 230 nm. ResultsPeoniflorin had a good linearrelationship in the range of 0.123 2～1.232 μg，the average recoveryof XiaoYao pill was 99.16% and the RSD was 1.6%. Conclusion Themethod is simple ，sensitive and rapid ，and reduce the damage ofbase material to the chromatographic column ,it can be applied tothe determination of peoniflorin in XiaoYao Pill．

　　Key words：XiaoYao Pill;   Peoniflorin;  SPE;   HPLC

　　逍遥丸（水丸）是由柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、炙甘草、薄荷七味中药细粉与生姜煎液混合后制成的水丸，具有舒肝健脾、养血调经之功效，适用于肝郁脾虚所致的郁闷不舒、胸胁胀痛、头晕目眩、食欲减退、月经不调等症［1］。液相色谱法具有专属性强、精密度高等优点，但对供试品溶液的净化要求高，本品为药粉直接入药，大量的基质会损伤色谱柱。饱和流出式固相萃取中药样品净化法具有简便快速、待测成分损失少、重现性好和能有效保护色谱柱等优点［2］，本文报道应用这种前处理方法制备供试品溶液，建立的逍遥丸中芍药苷含量的液相色谱测定法。现将结果报道如下。

　　1  仪器与试药

　　1.1 仪器美国Waters600液相色谱仪、Waters600E四元泵、717自动进样器、2487紫外可见光谱检测器、在线脱气装置、Empower色谱工作站、Agilent公司ZorbaxSBC18柱、固相萃取小柱（自制）,德国SartoriusBP221S（万分之一）、BT25S（十万分之一）电子天平。

　　1.2  试药逍遥丸（水丸，广州敬修堂药业股份有限公司，批号：C11018），芍药苷对照品（中国药品生物制品检定所提供，110736200423），氧化铝（上海五四化学试剂厂100200目），乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件［3］色谱柱：Agilent：ZorbaxSBC18柱（4.6 mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈水（20∶80）；流速：1 ml/min；检测波长230nm；柱温30℃，进样量5μl。在上述色谱条件下，芍药苷的保留时间为6.09 min。结果见图1。

　　2.2  对照品溶液的制备精密称取五氧化二磷干燥至恒重的芍药苷对照品1.85 mg，置10ml容量瓶中，加稀乙醇溶解，并稀释至刻度为储备液。精密移取储备液5 ml置25 ml容量瓶中，再精密加入10ml稀乙醇稀释，摇匀，即得质量浓度61.6 μg/ml的对照品溶液。

　　2.3  供试品溶液的制备取大小适中的空心注射针桶，底部置一塞板，加入5.0g中性氧化铝，即得自制的固相萃取小柱［4］，加样前小柱用3倍柱体积的水预洗进行活化。取逍遥丸适量，研细，取约0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 ml，密塞，称定重量，超声提取（功率250W，频率33kHz）40min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液经上述小柱，流出速度控制在0.4～0.6ml/min，收集第8～10 ml流出液作为供试品溶液。

　　2.4  标准曲线的制备用自动进样器分别吸取对照品溶液2，4，5，10，15，20μl进样，按上述色谱条件测定峰面积，以进样质量（μg）对峰面积（A）进行线性回归，求得回归方程：Y=79 546X－37610，r＝0.999 9，表明芍药苷在0.123 2～1.232 μg范围内呈良好的线性关系。

　　2.5  精密度实验精密吸取对照品溶液5μl，连续进样6次，测得峰面积响应值的RSD＝0.4％，表明系统精密度良好。

　　2.6  稳定性实验取同一批样品制得的供试品溶液，分别于0，2，4，6，8 h各进样5μl，记录色谱图，测得峰面积响应值的RSD＝0.3％，可见供试品在8 h内稳定。

　　2.7  重复性实验 同一批样品，平行精密称取6份，每份约0.8 g，按2.3方法制备供试品溶液，然后分别进样5μl，测得平均含量为4.298 mg/g，RSD＝1.6％，表明该法重复性好。

　　2.8  加样回收率实验 精密称取已知含量的样品（C11018）6份，分别置于具塞锥形瓶中，各精密加入对照品储备液（0.185 mg/ml）1ml,按2.3方法制备供试品溶液，进样测定。结果见表1。

　　a芍药苷对照品色谱图   b 溶液经前处理的色谱图   c 溶液未经前处理的色谱图

　　3  讨论

　　3.1 样品预处理和流出曲线的制备本品用稀乙醇作溶剂，大量的强极性大分子化合物被析出，将溶液直接照液相［3］，干扰组分太多，待测成分峰达不到基线分离，大量的基质对分析柱的损害大；溶液过固相萃取小柱时大量的基质被极性的氧化铝填料吸附，从而有效地保护分析柱，待测成分也达到了良好的基线分离效果。由于氧化铝对极性化合物的吸附力较强，因此，吸附在固相萃取小柱上的极性物质不易被溶剂洗脱下来，随着溶液的继续注入，固相萃取小柱对待测成分的吸附达到饱和状态，此时流出液中待测成分的浓度与注入小柱前的待测成分的浓度一致。以1ml为单位，收集萃取小柱的流出液11ml，编号依次进样测定，以流出体积为横坐标，各流出液中芍药苷峰面积与饱和流出段中芍药苷平均峰面积的百分比为纵坐标，绘制流出曲线。结果见图2。

　　从第8管（即第8毫升）起，固相小柱对芍药苷的吸附已达到饱和状态，为了保证实验的准确度，收集第8～10毫升流出液作为供试品溶液。

　　3.2 填料的选择实验了酸性、碱性、中性3种氧化铝作为柱填料，发现流出液中芍药苷含量的变化趋势无差别，但达到吸附饱和时芍药苷的含量有差别，以中性氧化铝为*，故作为本实验萃取小柱填料。

　　3.3 溶液浓度与填料用量的关系实验过程中我们发现溶液浓度与填料的用量成正比例关系，即溶液浓度低填料的用量少，浓度高填料用量多。但溶液浓度过高，待测成分提取不*；太低，溶液过萃取小柱的饱和段太窄，难以收集到准确的供试品溶液。本实验选取了溶液浓度0.016g/ml与5.0 g中性氧化铝填料的组成。