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反相液相色谱法测定地榆中金丝桃苷的含量

发布时间:2010-04-28浏览:984次

【摘要】目的建立地榆中金丝桃苷的液相色谱含量测定方法。方法采用RP-HPLC测定,C18柱,流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液(46∶54),用三乙胺调pH至3.0,流速1.0 ml·min-1,检测波长370 nm;供试品溶液的制备采用甲醇超声提取。结果测定了不同产地不同批次的地榆药材,金丝桃苷质量分数在0.052%~0.291%。结论该方法灵敏快速,准确可靠,可用于地榆的质量控制。

  【关键词】  地榆 金丝桃苷 反相液相色谱法

  Abstract:ObjectiveTo establish a determination method of hyperoside in Sanguisorba officinalis. MethodsRP-HPLC analytical method was established on a Polaris C18column with Methanol-0.2%H3PO4 solution(46:54) as the phase, the flow rate was 1.0 ml·min-1, and the detection wavelength was 370 nm. The method of sample was ultrasonic wave withdraws by Methanol. ResultsThe content of hyperoside was from 0.052~0.291% in different groups of S. officinalis collected from the different locations. ConclusionThe method is  accurate and can be used for the quality of Sanguisorba officinalis.

  Key words:Sanguisorba officinalis;   Hyperoside ;  RP-HPLC

  地榆为蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或长叶地榆Sanguisorba officinalis L.var.longifolia(Bert.)Yu et Li 的干燥根。其味苦、酸、涩,微寒,具有凉血止血、解毒敛疮之功效[1,2]。现代药理研究表明其具有显著的镇痛作用[3],主要有效成分为黄酮类化合物,但药典记载质量标准的定量检测方法仅为紫外-可见分光光度法测定其鞣质含量,该法操作繁琐。金丝桃苷为地榆药材中提取得到的黄酮类化合物。研究表明,地榆中的金丝桃苷是其止痛作用的有效成分之一。本实验采用RP-HPLC法对不同产地中药材市场商品地榆的金丝桃苷成分进行了定量分析,考察了流通商品地榆的质量状况,为进一步提高地榆药材的质量控制提供了科学依据。

  1  仪器与试药

  Agilent 1100液相色谱仪,含在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、智能柱温箱、紫外可见光检测器(VWD)、化学工作站。KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

  地榆药材于200607中下旬从青海省各地中药材市场抽取,由青海省药品检验所主任药师刘海青鉴定为地榆S. officinalis L.的干燥根或饮片。实验中将样品粉碎后过100目筛,置干燥器中备用。

  金丝桃苷(111521-200303,国药品生物制品检定所,供含量测定用)。甲醇为色谱纯,实验用水为Milli-Q超纯水。其他试剂均为分析纯。

  2  方法与结果

  2.1  对照品溶液的制备

  精密称取金丝桃苷13.25 mg,置量瓶中,加甲醇定容至25 ml,其金丝桃苷含量为0.53 mg·ml-1。再精密吸取金丝桃苷对照品溶液2.0 ml,加甲醇定容至50 ml量瓶中,其金丝桃苷含量为0.021 2 mg·ml-1。

  2.2  供试品溶液的制备

  取地榆干燥药材或饮片的粉末(过100目)1 g,分别精密称定,至具塞锥形瓶中,精密加入甲醇100 ml,称定重量,超声提取1 h,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,用续滤液作为供试品溶液。

  2.3  色谱条件

  Hypersil ODS2分析柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相甲醇-0.2%磷酸溶液(46:54),用三乙胺调pH至3.0;流速1.0 ml·min-1;检测波长370 nm;柱温25℃;进样量10 μl;在选定的色谱条件下,色谱柱的分离效率(简称柱效)>理论塔板数以金丝桃苷峰计算不低于3 000。分离度大于1.5,拖尾因子在0.95~1.05。色谱图见图1。

  2.4  检测波长的选择

  取金丝桃苷对照品适量,用甲醇溶解后作紫外全波长扫描,λ286,370 nm, 因286 nm下非黄酮物质也有吸收,为避免干扰,选择检测波长为370 nm。

  2.5  线性关系的考察

  分别精密吸取0.021 2 mg·ml-1的金丝桃苷对照品溶液2,4,6,8,10,12,16 μl注入液相色谱仪,测定基线构成之面积称峰面积。A=×σ×h=2.507σh=1.064 Wh/2h>峰面积,以金丝桃苷含量(X)为横坐标,其峰面积吸收度积分值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,其回归方程为:Y = 2 263.9X+2.963 5,r = 0.999  8(n =7),表明金丝桃苷在0.04~0.34 μg线性关系良好。
2.6  精密度实验

  精密吸取0.021 2 mg·ml-1金丝桃苷对照品溶液10 μl,连续进样5次,测得峰面积积分值RSD为0.86%,表明精密度良好。

  2.7  重复性实验

  精密称取同一样品粉末1 g(5份),按供试品溶液的制备方法制备,进样10 μl,测得金丝桃苷含量的RSD为0.99%,表明该方法的重复性好。

  2.8  稳定性实验同一供试品溶液,从制备完毕开始放置,分别于0,2,4,6,8,10 h进样检测,其峰面积积分值RSD为1.9%。表明供试品溶液在10 h内比较稳定。

  2.9  加样回收率实验

  取已知含量的药材(6号含量1.60 mg·g-1)样品6份,每份0.50 g,精密称定,计算样品中金丝桃苷量,分别加入适量的金丝桃苷对照品,按样品制备方法和测试条件进行测定,计算加样回收率。结果见表1。表1  地榆中金丝桃苷的加样回收率(略)

  2.10   样品测定

  分别精密吸取各样品10 μl进样测定,计算含量,结果见表2。 表2  不同产地地榆样品的金丝桃苷含量(略)

  3  讨论

  3.1  提取条件的选择

  根据金丝桃苷的溶解性能,选择乙醇、甲醇、醋酸乙酯作为提取溶剂,比较了3种提取溶剂提取方法(超声、回流及索氏提取)和不同提取时间(0.5,1.0,1.5 h)对提取效果的影响。结果显示采用超声提取方法的提取率zui高,甲醇提取效果,含量结果表明超声提取1.0 h可使待测成分提取完全。实验证实,含量并未随着提取时间延长而有所增加,超过1 h时含量甚至有下降的趋势。

  3.2   流动相的选择

  由于金丝桃苷为黄酮类化合物,本实验采用甲醇和0.2%磷酸溶液的二元流动相体系,但实验中发现拖尾峰(tailing peak)。前者少见。>色谱峰有拖尾现象。经反复实验发现,在1 000 ml的0.2%磷酸溶液中加入1.8 ml三乙胺时的分离效果zui佳,经多次,多批样品测试,系统具有良好的重复性和稳定性,三乙胺能与ODS柱中键合相的残余硅醇基相互作用,提高分离度,有助于改善峰形。因此以甲醇-0.2%磷酸溶液(46∶54)用三乙胺调pH至3.0为优,分离效果较好,保留时间适中,且无干扰[3]。本方法操作简便、快速、重复性好,适用于地榆中金丝桃苷含量的测定。

  3.3  样品分析

  本文对不同产地地榆中的金丝桃苷含量进行了测定,结果表明,不同产地金丝桃苷的含量存在着一定的差异,有必要对其进行质量控制。

  《中国药典》中地榆质量标准的定量检测方法操作较为繁琐,根据本实验的测定结果,RP-HPLC可以较好地对金丝桃苷进行有效分离,方法简便、准确、灵敏,可作为地榆质量控制的指标成分。

  【参考文献】
[1]国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部[S].北京:化学工业出版社,2005:83.

  [2]江苏新医学院. 中药大辞典,上册[M].上海:上海科学技术出版社,1981:806.

  [3]沙 明,曹爱民,孟宪生,等.液相色谱法在中药规范化研究中的应用[M].沈阳:辽宁科学技术出版社,2000:24.

 

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